電泳分析常用方法
(一)醋酸纖維素薄膜電泳
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?;纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小,幾乎能完全消除紙電泳中出現的“拖尾”現象,又因為膜的親水性比較小。
它所容納的緩沖液也少,電泳時電流的大部分由樣品傳導,所以分離速度快,電泳時間短,樣品用量少,5μg的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。
⒈材料與試劑?醋酸纖維素膜一般使用市售商品,常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液,濃度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要點
⑴膜的預處理:必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液,浸透后,取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液,不可吸得過干。
⑵加樣:樣品用量依樣品濃度、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規電泳分析,每cm加樣線不超過1μl,相當于60-80μg的蛋白質。
⑶電泳:可在室溫下進行。電壓為25V/cm,電流為0.4-0.6mA/cm寬。
⑷染色:一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅,糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑,脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
⑸脫色與透明:對水溶性染料最普遍應用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定,可浸入冰醋酸:無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。
(二)凝膠電泳
以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質的區帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)普遍用于分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大,對一般蛋白質不起分子篩作用,但適用于分離同工酶及其亞型,大分子核酸等應用較廣,介紹如下:
⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束,構成大網孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。
在臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的檢測。
⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術 在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中,DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數成反比;分子構型也對遷移率有影響,如共價閉環DNA>直線DNA>開環雙鏈DNA。
當凝膠濃度太高時,凝膠孔徑變小,環狀DNA(球形)不能進入膠中,相對遷移率為0,而同等大小的直線DNA(剛性棒狀)可以按長軸方向前移,相對遷移率大于0。